دانلود تحقیق با موضوع نرم افزار

از مرکز کلکسیون باکتریها و قارچهای صنعتی ایران با شماره PTCC(1734) خریداری گردید و همگام با سایرین آزمون شد که این سویه توانایی بسیار مناسبی در تولید سلولز داشت.
4-2-شناسایی سویه های باکتریایی
همانگونه که در مبحث مواد و روش ها اشاره گردید، شناسایی سویه های باکتریایی از طریق بررسی فنوتایپینگ و ژنوتایپینگ انجام شد. در مرحله شناسایی، تنها به شناسایی 5 جدایه باکتری که از میان سایرین دارای بالاترین توانایی تولید سلولز بودند، پرداخته شد.
4-2-1-بررسی های فنوتایپینگ سویه های باکتریایی
همانگونه که در مبحث مواد و روش ها آورده شده است، در ابتدا خصوصیات ماکروسکوپی و میکروسکوپی نمونه های مختلف باکتریایی بررسی شد.
4-2-1-1خصوصیات ماکروسکوپی
گلوکونوباکترها و استوباکترها دارای سلولهای بیضی شکل مایل به میله ای، راست یا کمی خمیده به صورت تکی، دوتایی، زنجیره ای بودند که اغلب رنگ کلونی ها به صورت رنگ پریده و در برخی نژادها همراه با رنگدانه مشاهده شدند. در اینجا از استوباکتر زایلینوس به عنوان شاهد این آزمون استفاده شد که دارای کلونیهایی به رنگ سفید مایل به کرم، کروی با حاشیههای مضرسی، تخت و فاقد قوام کرهای بود.
4-2-1-2- خصوصیات میکروسکوپی
بعد از انجام رنگ آمیزی گرم، مشاهده میکروسکوپی لامها انجام شد. وجود باسیلهای گرم منفی تائیدی بر وجود باکتری گلوکونوباکتر و استوباکتر بود.(شکل 4-1)
شکل( 4-1). مشاهده میکروسکوپی باسیلهای گرم منفی
4-2-1-3- لام مرطوب
از این روش همانگونه که در بخش مواد وروشها گفته شد جهت تشخیص باکتری ها از مخمرها استفاده گردید و هیچگونه مخمری مشاهده نشد در صورتی که باکتریها به صورت متحرک قابل مشاهده بودند.
4-2-1-4-رنگ آمیزی مالاشیت سبز
شاهد در این آزمون باکتری باسیلوس سرئوس بود که سلولهای رویشی باکتری به رنگ قرمز-قهوه ای و اسپورها288 به رنگ سبز کمرنگ دیده شدند و در شکل زیر به نمایش گذارده شده است. اما آزمایشات انجام گرفته هیچ گونه اسپوری در زیر میکروسکوپ مشاهده نگردید. (شکل 4-2)
(شکل 4-2) رنگ آمیزی مالاشیت سبز در باسیلوس سرئوس
4-3- آزمونهای بیوشیمیایی
نتایج این آزمونها برای تمام نمونهها به یک شکل بود و تمام نمونهها حضور جنسهای گلوکونوباکتر و استوباکتر را تایید نمود. تمامی نمونه ها کاتالاز مثبت، اکسیداز منفی، ایندول منفی، ژلاتین منفی، دارای حرکت و بدون تولید H2S بودند.
4-4- بررسی های ژنوتایپینگ سویه های باکتریایی
4-4-1- استخراج DNA
همانگونه که اشاره گردید، جهت شناسایی مولکولی سویه های باکتریایی، اولین مرحله استخراج DNA از نمونه ها بود. DNAنمونه های باکتریایی شناسایی شده در حد گونه، در این مرحله توسط روش فنل- کلروفورم استخراج گردید. سپس DNA استخراج شده بر روی ژل آگاروز لود شد و پس از انجام الکتروفورز کیفیت آن بررسی گردید که در حد قابل قبول و مورد انتظار بوده است. باند DNA با کیفیت خوب به دلیل سنگینی آن در بالای ژل قرار گرفت(شکل 4-3).
علاوه بر این همانگونه که در بخش مواد و روش ها اشاره شد، غلظت DNA استخراج شده باکتریایی به وسیله دستگاه نانودراپ بررسی گردید. سپس DNA به وسیله آب مقطر رقیق و غلظت آن به حدود 30 تا 35 نانوگرم رسانیده شد تا با شرایط گفته شده جهت واکنش زنجیره پلیمرازاستفاده شود. شکل( 4-3)نمونه ای از غلظت DNA به دست آمده از دستگاه نانودراپ را نمایش می دهد.
شکل (4-3) نمایش ژل الکتروفورز حاصل از استخراج DNAچند نمونه باکتریایی.
چاهک نشان داده شده با حرف M مارکر و چاهک های شماره 1 و 2 به ترتیب مربوط به DNA استخراج شده از باکتری های شماره 1 و 5 می باشند. چاهک شماره 3 و 4 مربوط به پرایمر 1389R و 63F می باشند. چاهک شماره 8 نیز کنترل منفی و حاوی آب مقطر است.
شکل( 4-4) نمونه ای از غلظت DNA به دست آمده از دستگاه نانودراپ.
نمونه فوق متعلق به باکتری شماره 1 بوده و رقیق شده است. همانگونه که نشان داده شده است، در طول موج 260 نانومتر، غلظت DNA در حدود 8/39 است که نسبت 280/260 و 230/260 آن نیز مناسب می باشد.
4-4-2- تکثیر توالی 16SrDNA
غلظت پرایمرهای مورد استفاده در این آزمون ابتدا به وسیله نانودراپ تعیین گردید که برای پرایمر 63Fحدود 208 نانوگرم و برای پرایمر 1389Rحدود 420 نانوگرم بود. الکتروفورز پرایمرها نیز انجام شد که همانطور که شکل (4-5) نشان می دهد غلظت پرایمرها قابل قبول بوده اند. سپس جهت تعیین دمای بهینه جوش خوردن پرایمرها از گرادیان289 دمایی در واکنش زنجیره پلیمراز استفاده شد که در نهایت دمای1/59 درجه سلسیوس به عنوان دمای بهینه جهت جوش خوردن پرایمرها به DNA الگو تعیین شد. پس از انجام واکنش زنجیره پلیمراز طبق آنچه در مواد و روش کار آورده شده است، محصول واکنش زنجیره پلیمراز بر روی ژل آگارز 1% الکتروفورز گردید و حضور باندی به اندازهbp 1299 در حضور مارکر kb 1 مشاهده گردید(شکل4-5). سپس جهت انجام تعیین توالی قطعات به دست آمده، محصول واکنش زنجیره پلیمراز بر روی ژل آگارز با دمای ذوب پایین در درون چاهک های تعبیه شده بزرگ تر الکتروفورز گردید و باند DNA نهایتا طبق دستورالعمل گفته شده در پیش استخراج شد.
شکل (4-5) الکتروفورز محصول واکنش زنجیره پلیمراز بر روی ژل آگارز 1%. M: مارکر 1 کیلو جفت باز.
هر چاهک مربوط به محصول واکنش زنجیره پلیمراز یک باکتری می باشد. باند 1299 جفت باز مشخص شده است و چاهک های شماره 1 و 2 کنترل منفی می باشند. (چاهک 1 حاوی آب مقطر و 2 شاهد فاقد DNA الگو می باشد.)
4-4-3-تعیین توالی قطعات حاصل از واکنش زنجیره پلیمراز
همانگونه که در مبحث روش ها آورده شده است، محصول واکنش زنجیره پلیمراز مربوط به هر نمونه به صورت یک جهته تعیین توالی گردید و در این مرحله نمونه ها در حد گونه شناسایی شدند. نتایج حاصل از تعیین توالی توسط نرم افزار Bioedit بررسی و سپس در برنامهBLASTn در سایت NCBIبا توالی 16S rDNA (مربوط به باکتری ها) مقایسه شد. نتایج این بررسی در جدول 4-1 به صورت خلاصه آورده شده اند.
جدول4-1- نتایج تعیین توالی به دست آمده برای نمونه های باکتریایی
شماره
شماره ورود290
پراکندگی
291درصد شباهت
1
NR_042762.1
گلوکونوباکترسوئینگسی نژاد292DSTGL01
99%
NR_041012.1
گلوکونوباکتر ناتای کلا نژاد293LMG1536
98%
2
NR_026435.1
گلوکونوباکتراینترمدیوس نژاد294TF2
99%
3
NR_041295.1
گلوکونوباکتر ابداینس نژاد295 DSM11826
99%
NR_026513.1
گلوکونوباکتر یوروپائوس نژاد296DES11
97%
4
NR_026325.1
استوباکتر کاربینولایکوم نژاد297DSM 2925
100%
NR_026323.1
استوباکتر وودی نژاد298DSM 1030
99%
5
NR_026329.1
استوباکتر باکی نژاد299DSM 8239
100%
4-5-نتایج خالص سازی و شستشو توسط NaOH
در خالص سازی لایه تولیدی لایه محکم بدون شکستگی با pH خنثی نهایتا به دست آمد.
(شکل4-6)خالص سازی لایه سلولز تولیدی
4-6-تستهای تاییدی سلولز
4-6-1-هضم آنزیمی
جهت بررسی وجود لایه سلولزی از روش هضم آنزیمی توسط آنزیم سلولاز استفاده شد. لایه سلولزی توسط آنزیم سلولاز حل گردید که تائیدی بر وجود لایه سلولز تولید شده توسط باکتریهای استوباکتر و گلوکونوباکتر بود.
4-6-1-1-آزمون مولیش و بندیکت
در بررسی وجود قند در لایه سلولزی و تایید نوع قند (آزمون مولیش و بندیکت) بعد از اضافه کردن معرف مولیش به محلول حاصل از هضم آنزیمی حالت دو فازی در محلول فوق اتفاق افتاد و بین دو فاز محلول حلقه ای بنفش رنگ پدیدار شد که معرف وجود قند احیا کننده در لایه سلولزی به دست آمده بود.
در مرحله بعدی جهت تعیین نوع قند آزمون بندیکت انجام شد و وجود قند گلوکز با پدیدار شدن رنگ قرمز، زرد یا سبز بلافاصله تایید شد (شکل4-7).
شکل(4-7) بررسی وجود قند (آزمون مولیش) در سمت راست و بررسی نوع قند(آزمون بندیکت) در سمت چپ
4-6-2-بررسی میکروسکوپ الکترونی نگاره
در این بررسی بستری از لایه سلولزی به صورت خالص مشاهده گردید.
(شکل 4-8) شکل میکروسکوپ الکترونی نگاره از لایه سلولزی
4-7-بررسی تولید نانوذرات نقره توسط باکتری ها
تجمع نانو ذرات نقره با تغییر رنگ محیط از زرد به قهوه ای تیره دلیلی بر صحت تولید نانوذرات نقره توسطگلوکونوباکترها و استوباکترها بود. در این آزمون لایه ای قهوه ای، قطور و محکم مشاهده شد. (شکل 4-9)
(شکل 4-9) بررسی تولید نانوذرات نقره توسط باکتری ها، شکل سمت راست لایه سلولزی خالص قبل از تولید نانوذرات و شکل سمت چپ بعد از تولید نانوذرات می باشد.
4-8-تست های تاییدی تولید نانوذرات نقره
همانگونه که در فصل مواد و روش ها مطرح شد، جهت تایید تولید نانوذرات نقره آزمونهای تاییدی انجام گردید و تولید نانوذرات تایید شد.
4-8-1-بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره
نتایج بررسی به وسیله میکروسکوپ الکترونی گذاره حضور نانوذرات نقره را در سوپرناتانت کشت میکروارگانیسم ها تایید نمود. نانوذرات نقره به صورت کروی و چند شکلی بودند که پراکنده و با فاصله در محیط وجود داشتند که سایز متوسط آن ها حدود 50 تا 100 نانومتر بود. شکل 4-10 نانوذرات نقره تولیدی را توسط باکتری ها نشان می دهد.
شکل( 4-10 ) مثالی از تصاویر میکروسکوپ الکترونی گذاره که نانوذرات نقره تولیدی توسط باکتری ها نشان می دهد. (Scale Bars = 250 nm).
4-8-2-پراش اشعه ایکس
به منظور تایید تولید نانوذرات نقره توسط سویه باکتریایی منتخب، نمونه حاوی نانوذرات به صورت پودر خشک درآمد و توسط دستگاه XRD در زاویه2? از 30 درجه تا 80 درجهمورد بررسی قرار گرفت. همانطور که شکل 4-11 نشان می دهد، پیک جذب برای نقره به صورت فلزی قابل مشاهده بوده است.
(شکل4-11) نتیجه تست پراش اشعه ایکس برای نانوذرات نقره
4-8-3- بررسی اسپکتروفتومتری
پس از مشاهده تغییر رنگ حاصله از احیاء یون های فلزی به نانوذرات، نمونه ها توسط اسپکتروفوتومتر در طول موج 350 تا 750 نانومتر بررسی شدند. بلانک300 مورد استفاده در اسپکتروفوتومتر، سوپرناتانت میکروارگانیسم کشت داده شده در محیط کشت نوترینت براث بود که نمک فلز به آن افزوده نشده بود. جدول 4-2 نتایج اسپکتروفوتومتر را برای نمونه های انتخاب شده جهت مطالعات بیشتر نشان می دهد. شکل4-12 نیز نمونه ای از نتایج اسپکتروفوتومتر به دست آمده برای نانوذرات نقره را نشان می دهد.
جدول( 4-2 ) نتایج اسپکتروفوتومتر برای بهترین نمونه ها
شدت جذب
طول موج جذب
شماره نمونه
نانوذرات نقره
719/1
410
1
805/1
420
2
873/1
430
3
551/1
440
4
949/1
450
5
(شکل4-12) نتایج اسپکتروفوتومتر به دست آمده برای نانوذرات نقره که دارای بیشینه جذب در حدود 440 نانومتر است.
4-9-تولید نانوذرات نقره در درون بستر سلولزی به روش آر-تی
در این آزمون لایه ای که دارای نانو ذرات نقره بود در سمت راست و لایه ای که فاقد نانو ذرات نقره در سمت چپ به نمایش گذاشته شده است. اشکال مدور در شکل سمت راست حاکی از وجود نانوذرات تولیدی بر روی لایه سلولزی میباشد و شکل سمت راست بدون اشکال مدور حاکی از وجود لایه سلولزی به صورت خالص و بدون نانوذرات است.
(شکل4-13) تولید نانوذرات نقره در درون بستر سلولزی به روش آر-تی
4-10- بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره
بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره برای 4 باکتری اشرشیا کلی، استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس و سودوموناس آئروژینوزا با دیسک های سلولزی به عنوان شاهد و کنترل با قطر 6 میلی متر انجام شد. نتایج این بررسی بصورت زیر است.
جدول 4-3 بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی

دیدگاهتان را بنویسید