دانلود تحقیق با موضوع سی، باکتری، گردید.

گرمخانه گذاری شد مرحله مذکور تا به دست آمدن تک کلونی های خالص تکرار گردید. پس از آن کلونی ها از نظر خصوصیات فنوتایپی و تست های متداول بیوشیمیایی بررسی شدند. همگام با این بررسی، سویه استوباکتر زایلینوس باPTCC 250 شماره(1734) به عنوان شاهد از کلکسیون قارچ ها و باکتری های صنعتی ایران خریداری گردید و در مرحله بعد، یک لوپ از کلونی های فوق به طور جداگانه به درون ارلن های 100 سی سی حاوی محیط کشت شرام – هسترین مایع251ومایع مغذی252اضافه شد و پس از آن نمونه ها به مدت 1 هفته در دمای 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری گردید. باکتریهای خالص شده از نظر تشکیل و یا عدم تشکیل لایه سفید رنگ، لزج، محکم و قطور بر روی محیط کشت مایع مورد بررسی قرار گرفتند و وجود توانایی تولید لایه سلولزی توسط باکتری ها تایید شد
(Dearing, 2000; Sattler and Fiedler, 1990; Saxena et al., 1994; Thawatchai et al., 2007 and Yong et al., 2012).
3-2-1-1- محیط کشت هیسترین اسکرام
مواد مورد استفاده در این محیط کشت در جدول 3-3 آورده شده است. به این ترتیب که ابتدا مواد ذیل با تناسب وزن، سپس با آب مقطر درون ارلن مخلوط و پس از اتوکلاو253 در دمای 121 درجه سلسیوس به مدت 15 دقیقه، آنتی بیوتیک نیستاتین254 (1 گرم در 100 سی سی آب مقطر به وسیله فیلتر میلی پور استریل شد) جهت خاصیت قارچ کشی در دوز مناسب به مواد فوق در ارلن اضافه شد و محیط کشت مزبور آماده گردید . مواد مورد استفاده در جدول 3-3 آورده شده است(et al., 2002 Ishihara).
جدول 3-3. مواد تشکیل دهنده محیط کشت هیسترین اسکرام
غلظت (بر حسب گرم)
پیش مواد
2 گرم
گلوکز
0/5 گرم
عصاره مخمر
0/5 گرم
پپتون
5/1 گرم
آگار آگار
27/0گرم
دی سدیم هیدروژن فسفات
115/0 گرم
100 سی سی
اسید سیتریک
آب
3-2-2-انتخاب و شناسایی سویه های باکتریایی
از میان باکتری های جداسازی شده، جهت مطالعات بیشتر، آنهایی انتخاب شدند که توانایی تولید لایه سلولزی را داشتند و شناسایی بر روی این سویه ها انجام شد.
به این صورت شناسایی سویه های باکتریایی از دو طریق شناسایی فنوتایپی255 و ژنوتایپی256 انجام گردید.
3-2-2-1-بررسی های فنوتایپینگ سویه های باکتریایی
جهت شناسایی سویه ها همانطور که در بخش 2-2-1 آمده است، از خواص ماکروسکوپی و میکروسکوپی آن ها استفاده گردید. در بررسیهای ماکروسکوپی کشت 12 تا 24 ساعته از هر باکتری در محیطهای کشت هیسترین اسکرام آگار بررسی شد که حالت، شکل، منظره سطح، رنگ و اندازه کلنیها بررسی گردیدند.
3-2-2-1-1-رنگ آمیزی گرم257
جهت رنگ آمیزی هر باکتری، کشت تازه از باکتری در محیط کشت هیسترین اسکرام آگار تهیه شد و برای رنگ آمیزی مورد استفاده قرار گرفت. به منظور بررسی خصوصیات میکروسکوپی باکتری و همچنین تشخیص نوع واکنش گرم، لامهای متوالی در زمان های 12، 24 و 48 ساعت پس از کشت باکتری تهیه و با رنگ آمیزی گرم رنگ آمیزی و مطالعه گردید.
3-2-2-1-2- روش لام مرطوب258
روش کار به این صورت است که در ابتدا از محیط کشت 24 ساعته هیسترن اسکرام مایع، یک قطره بر روی لام قرار داده سپس سطح آن را با لامل پوشانیده و در زیر میکروسکوپ توانایی تحرک باکتری ها مشاهده می شود.
3-2-2-1-3-رنگ آمیزی مالاشیت سبز259
پس از فیکس کردن باکتری ها بر روی لام، به ترتیب ابتدا مالاشیت سبز با حرارت ملایم به مدت 5دقیقه بر روی لام قرار داده شد سپس لام را شستشو و سافرانین260 به مدت 1 دقیقه بر روی لام قرار گرفت نهایتا لام را شستشو و در زیر میکروسکوپ با عدسی 100 و روغن ایمرسیون مشاهده گردید.
در این روش رنگ آمیزی از باکتری باسیلوس سرئوس261 که نمادی از باسیل اسپور دار است به عنوان شاهد استفاده شد(et al., 2008 Raducan).
3-2-2-1-4-آزمون کاتالاز262
به منظور جداسازی باکتریهای تولید کننده پراکسید هیدروژن263، ابتدا یک لوپ از باکتری مورد نظر را بر روی لام قرار گرفت سپس به آن محلول %3 از H2O2 اضافه شد. چنانچه باکتری کاتالاز مثبت باشد از آن گاز خارج میگردد و چنانچه کاتالاز منفی باشد هیچ گازی خارج نمیگردد(باصری صالحی و بهادر، 1391).
3-2-2-1-5- آزمون اکسیداز264
در این آزمون از دیسک های کاغذی حاوی معرف پارافنیلن دی آمین265 که به صورت تجاری در دسترس است، استفاده شد. یک کلنی از میکروارگانیسم مورد آزمون در روی دیسک به وسیله میله شیشه ای پخش شد و چنانچه باکتری حاوی آنزیم فوق الذکر بود، پس از 10 ثانیه رنگ دیسک به بنفش تغییر کرد که نشان دهنده مثبت بودن آزمون بود (باصری صالحی و بهادر، 1391).
3-2-2-1-6- آزمون حرکت، ایندول و تولید ( سولفید هیدروژن)266 (267SIM)
با استفاده از محیط کشت نیمه جامد SIM این آزمون انجام شد. به این ترتیب که باکتری را به وسیله آنس به درون محیط کشت نیمه جامد درون لوله آزمایش وارد و پس از 24 ساعت گرمخانه گذاری در حرارت حدود 35-37 درجه سلسیوس، تحرک به وسیله ظاهر ابری شکل محیط کشت، تولید ایندول با استفاده از معرف کواکس268و تولید H2S با تغییر رنگ محیط کشت به سیاه قابل مشاهده بود (باصری صالحی و بهادر، 1391).
3-2-2-1-7-آزمون ژلاتین269
این آزمون جهت باکتریهایی استفاده میشود که توانایی تولید آنزیم ژلاتیناز جهت ذوب ژلاتین که نوعی اسید آمینه ناقص و فاقد اسیدآمینه تریپتوفان است را دارد. نهایتا پس از ذوب ژلاتین مخلوطی از اسید آمینه ها به دست میآید. بدین صورت که جدایهها به محیط کشت ژلاتین غذایی پس از اتوکلاو و سرد شدن تلقیح گردید. نهایتا اگر در تمامی لوله یا در بخش بالایی آن سیالیت مشاهده شد آزمون مثبت ودر غیر این صورت منفی می باشد. قابل ذکر است که نتایج با شاهد مقایسه شد و وجود شاهد ضروری می باشد(باصری صالحی و بهادر، 1391).
3-2-3-بررسی های ژنوتایپینگ سویه های باکتریایی
شناسایی مولکولی جدایه های تولید کننده سلولز با استفاده از تکثیر قطعه ای از توالی 16SrRNA برای باکتری ها انجام گرفت که در زیر شرح داده می شود.
3-2-3-1-استخراج DNA از میکروارگانیسم ها
جهت استخراج DNA از روش فنل-کلروفورم استفاده گردید. در زیر به صورت خلاصه مراحل کلی استخراج DNA آورده شده است.
3-2-3-1-1-تهیه محلول – فنل- کلروفرم- ایزوآمیل الکل
100 گرم از فنل در بشر بر روی همزن مغناطیسی و در زیر هود، تا C°68 جهت ذوب حرارت داده شد. سپس به میزان 1/0% هیدروکسی کوئینولین به آن افزوده و هم حجم آن بافر تریس 5/0 مولار (5/8 pH) اضافه سازی شد و حدود 15 دقیقه بدون حرارت دادن و با استفاده از همزن مغناطیسی به هم زده شد.سپس تا جایی که ممکن بود فاز آبی را خارج و دوباره هم حجم آن از بافر تریس 1/0 مولار (5/8 pH) اضافه شد و به مدت 15 دقیقه به هم زده شد. پس از استخراج فاز آبی، pH آن اندازه گیری شد و اگر از 4/7 کمتر بود مجددا فاز رویی استخراج شد و بافر تریس 1/0 مولار اضافه گردید تا pH آن به بالاتر از 4/7 رسید. نهایتا به نسبت 25-24-1 به ترتیب فنل- کلروفرم و ایزوآمیل الکل اضافه شد و با افزودن بافر تریس 1/0 مولار به آن، در درون شیشه های تاریک و یخچال نگهداری گردید(Pourali et al ., 2009).
3-2-3-2-نحوه استخراج DNA از میکروارگانیسم ها
ابتدا تک کلنی مربوط به سویه میکروبی درون محیط کشت مایع مغذی به مدت 24 ساعت برای باکتری ها کشت داده شد. سلول های میکروبی درrpm 6000 سانتریفیوژ شدند و رسوب سلولی 3 مرتبه توسط آب مقطر استریل شستشو داده شد. از بافر 270 RSB( 1سی سی از Tris-HCl(1 مولار)، 200 مایکرولیتر از NaCl(5 مولار) و 5 سی سی از EDTA(5/0 مولار) در حجم نهایی 100 سی سی از آب مقطر) بر روی میکروارگانیسم ها به میزان 600 مایکرولیتر اضافه سازی گردید و نمونه به درون میکروتیوب 5/1 سی سی وارد شد. سپس 60 مایکرولیتر از SDS %10 (10 گرم در حجم نهایی 100 سی سی از آب مقطر) به سوسپانسیون میکروبی اضافه و نمونه ها هم زده شدند و 5 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند. حدود 800 مایکرولیتر از محلول فنل- کلروفورم- ایزوآمیل الکل به میکروتیوب ها اضافه سازی گردید و نمونه ها به مدت 5 دقیقه در دور g10000 سانتریفیوژ گردیدند. سپس فاز آبی استخراج و به درون میکروتیوب جدید وارد شد و هم حجم آن کلروفرم اضافه سازی شد. نمونه ها به مدت 5 دقیقه در دور g 10000 سانتریفیوژ گردیدند. پس از آن مجددا فاز آبی از میکروتیوب ها استخراج شد و 12 مایکرولیترNaCl 5 مولار سرد (2 /292 گرم در حجم نهایی 1000 سی سی از آب مقطر) به محلول اضافه سازی شد و بلافاصله حدود 800 مایکرولیتر اتانول 100 درجه سرد به محلول اضافه سازی گردید. نمونه ها به مدت 15 دقیقه در دور g13000 سانتریفیوژ شدند و رسوب حاصل به وسیله 50 مایکرولیتر اتانول 70 درجه شستشو داده شد. نهایتا نمونه ها مجددا به مدت 5 دقیقه در دور g13000 سانتریفیوژ شدند. سپس به رسوب حاصل 50 مایکرولیتر بافر TE (10 سی سی از بافر ) Tris-Cl 1 مولار، 5/7 pH)و 2 سی سی از) EDTA 5/0 میلی مولار، 8 pH) در حجم نهایی 1000سی سی آب مقطر) اضافه سازی شد و پس از حل شدن DNAدر آن، نمونه ها در درون فریزر 20- درجه سلسیوس تا زمان انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز271 قرار گرفتند.
جهت ارزیابی کیفیتDNA استخراج شده، 3 مایکرولیتر از آن با 3 مایکرولیتر از بافر لودینگ272 (4 گرم سوکروز و25 میلی گرم بروموفنل بلو در حجم نهایی 10 سی سی آب مقطر) مخلوط و درون ژل آگارز 1% الکتروفورز گردید. حرکت نمونه درون ژل الکتروفورز با استفاده از بافر TBE (6/21 گرم تریس، 11 گرم اسید بوریک، 4 سی سیEDTA ( 5/0 مولار، 8 pH) در حجم نهایی 1000 سی سی آب مقطر) با ولتاژ 70 ولت انجام شد. غلظت آن نیز به وسیله دستگاه نانودراپ بررسی شد. نهایتا غلظت DNAبه وسیله آب مقطر استریل به 35 نانوگرم رسانیده شد تا واکنش زنجیره ای پلیمراز به خوبی قابل انجام باشد .
3-2-3-2-1-تهیه ژل آگارز 1%
5/0 گرم آگارز وزن و به وسیله بافر TBE 1X استریل حجم آن به 50 سی سی رسانیده شد. سپس به منظور انحلال آگارز، محلول در دمای 100 درجه سلسیوس حرارت داده شد تا کاملا شفاف گردید. ژل تا دمای 40 درجه سلسیوس سرد شد و درون آن به حجم نهایی 5/0 مایکرو گرم در هر میلی لیتر از محلول رنگ اتیدیوم بروماید (0001/0 گرم اتیدیوم در 100 سی سی آب مقطر) اضافه شد. نهایتا ژل به درون سینی الکتروفورز پس از گذاشتن شانه ها ریخته شد(Pourali et al ., 2009).
3-2-3-3-پرایمر273های مورد استفاده جهت شناسایی مولکولی باکتری ها
جهت انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز توالی پرایمرها از مقالات استخراج و سپس در سایت NCBI در برنامه BLASTn مورد بررسی قرار گرفتند و مناسب ترین توالی پرایمرها برگزیده شدند. همانگونه که اشاره شد، پرایمرهای باکتریایی مورد استفاده در این آزمون مربوط به قطعه ژنی16S rRNA که قطعه ای به طول 1299 جفت باز را سنتز می نمودند (Calamassi et al., 2008) توالی پرایمرهای مورد استفاده در جدول 3-4 آورده شده اند.
جدول3-4- توالی پرایمرهای مورد استفاده برای باکتری ها
منبع
توالی
پرایمر
نام
پرایمر
نوع
پرایمر
ارگانیسم
Calamassi et al., 2008
´3-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-´5
63F
R
باکتری
Calamassi et al., 2008
´3 ACGGGCGGTGTGTACAAG- -´5
1389R
F
3-2-3-4-واکنش زنجیره پلیمراز برای باکتری ها
پرایمرها طبق دستورالعمل شرکت تولید کننده (آرین ژن گستر) رقیق و سپس غلظت آن ها بر اساس نانوگرم به وسیله دستگاه نانودراپ بررسی گردید. پس از آن بر روی ژل آگارز 1% طبق بخش 2-2-3-2-1الکتروفورز گردیدند تا باند قابل قبول آن ها بر روی ژل مشاهده گردد. ابتدا جهت تعیین دمای بهینه جوش خوردن پرایمرها از شیب دمایی (57، 7/57، 4/58، 1/59، 9/59، 6/60،

دیدگاهتان را بنویسید