دانلود تحقیق با موضوع استاندارد

3/61، 62، 8/62، 5/63، 2/64 و 65 درجه سلسیوس) در واکنش زنجیره ای پلیمراز استفاده شد (Wang et al., 2010). واکنش زنجیره ای پلیمراز در مخلوطی به حجم 20 مایکرولیتر انجام شد. پیش مواد مورد استفاده به ترتیب از این قرار بودند: 2 مایکرولیتر X PCR buffer10، 4/1 مایکرولیتر MgCl2 (25 میلی مولار)، 4/0 مایکرولیتر dNTP (10 میلی مولار)، 1 مایکرولیتر پرایمر F (10 میلی مولار)، 2/2 مایکرولیتر پرایمر R (10 میلی مولار)، 1 مایکرولیتر DNA و 2/0 مایکرولیتر Taq DNA پلی مراز (5 واحد) در 8/ 11مایکرولیتر آب مقطر مخلوط شدند. شرایط واکنش زنجیره ای پلیمراز طبق جدول 2-5 بود.
جدول 3-5- مراحل انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز
تعداد سیکل
مراحل واکنش زنجیره ای
پلیمراز
زمان
( بر حسب دقیقه)
دما
(بر حسب درجه سلسیوس)
1
دناتوراسیون اولیه
5
94
30
دناتوراسیون
1
94
جوش خوردن
1
1/59
طویل شدن
2
72
1
طویل شدن نهایی
10
72
نهایتا محصول واکنش مانند شرایط گفته شده در بخش 2-2-3-2-1 الکتروفورز گردید. جهت مشاهده قطعات DNA تکثیر شده، ژل در درون دستگاه ترانس لومیناتور قرار داده شد و به وسیله نور UV، DNA با سایز 1299جفت باز ردیابی شد.
3-2-3-5-تعیین توالی قطعات حاصل از واکنش زنجیره ای پلیمراز
جهت انجام تعیین توالی قطعات به دست آمده، محصول واکنش بر روی ژل آگارز 1% با دمای ذوب پایین به همراه بافر لودینگ و با ولتاژ 50 ولت الکتروفورز گردید و پس از مشاهده باند DNA بر روی ژل توسط دستگاه ترانس لومیناتور به وسیله تیغ بیستوری قطعه آگارز حاوی باند DNA بریده شد و به میکروتیوپ تمیز وارد و فرایند استخراج DNA از ژل آگارز طبق پروتوکل موجود در کیت استخراج DNA از روی ژل انجام شد(GF-1Vivantis). نهایتا DNA استخراج شده همراه با پرایمر 63F جهت تعیین توالی ژنوم باکتری ها و ارسال شد. نمونه ها به صورت یک جهته تعیین توالی گردیدند و پس از دریافت نتایج، توالی های به دست آمده با استفاده از برنامه BLASTn در سایت NCBI با توالی های 16S rRNA موجود مقایسه گردید.
3-2-4-خالص سازی سلولز تولیدی
در این بخش، بررسی بر روی تمامی سویه های باکتریایی با توانایی تولید سلولز انجام شد. به دلیل اینکه لایه سلولز تولیدی در محیط کشت، ممکن است با اندکی ناخالصی همراه باشد، این لایه های سلولزیپاکسازی شدند. علاوه بر این برخی از میکروارگانیسم ها توانایی تولید مواد ضد میکروبی را در سوپرناتانت خود دارندکه باید سلولز به دست آمده را از آنتی بیوتیک های تولیدی در محیط کشت به روشی جداسازی نمود. این حالت پیش از انجام بررسی اثرات ضد میکروبی بر روی باکتری های بیماریزا، مهم است که طی آن لایه های سلولز به دست آمده با روش زیر، پاکسازی شد (.(Yang et al., 2012
3-2-4-1- شستشو به وسیله هیدروکسید سدیم274
در این روش جهت شستشو غشاء سلولزی توسط NaOH 1% به مدت 2 ساعت جوشانیده شد سپس NaOH تخلیه شد و لایه 2ساعت دیگر به وسیله آب مقطر جوشانیده شد این دو مرحله سه بار تکرار شدند نهایتا غشاء به وسیله آب مقطر تا رسیدن pH آن به pH خنثی شسته شد و قبل از استفاده اتوکلاو شد و در درون آب مقطر استریل قرار گرفت(.(Yang et al., 2012
3-2-5-تستهای تایید سلولز
جهت تایید جنس لایه، از روش هضم آنزیمی لایه تولیدی توسط آنزیم سلولاز275 و میکروسکوپ الکترونی نگاره استفاده گردید.
3-2-5-1-هضم آنزیمی276
پس از خالص سازی و شستشوی لایه سلولزی، جهت تایید جنس لایه، نمونه داخل بشر قرار گرفت. جهت هضم آنزیمی، از آنزیم سلولاز به میزان 5/2% در بافر سیترات 1 مولار(5/29 میلی لیتر سدیم سیترات 1 مولار + 5/20 میلی لیتر اسید سیتریک 1مولار) به نمونه داخل بشر اضافه گردید. پس از آن مخلوط فوق به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه شد و بعد از فیلتر نمودن محتویات بشر توسط فیلتر کاغذی، محلول فیلتر شده جهت تایید وجود قند و تشخیص نوع قند، مورد بررسی قرار گرفت(et al., 2003Joseph).
3-2-5-1-1-آزمون مولیش و بندیکت277
در آزمون مولیش به محلول حاصل از هضم آنزیمی ابتدا چند قطره معرف مولیش اضافه شد تا وجود قند مشخص گردید و سپس جهت تایید نوع قند به محلول مورد آزمون چند قطره معرف بندیکت اضافه شد و بعد از جوشیدن به مدت 5 دقیقه محلول حاصل سرد گردید. آزمون بندیکت جهت تشخیص آلدهید های خطی و شناسایی قند ها کاربرد دارد( . (Benedict, 1908;Molisch, 1886
3-2-5-2-میکروسکوپ الکترونی نگاره278
جهت بررسی به وسیله میکروسکوپ الکترونی نگاره، لایه های سلولز تولیدی بعد از شستشو وخشک نمودن جهت عکسبرداری آماده شد(McMullan et al., 2006).
3-2-6- بررسی تولید نانوذرات نقره توسط استوباکترها و گلوکونوباکترها
جهت تولید نانوذرات در ابتدا هر تک کلنی از باکتریهایی که توانایی تولید سلولز داشتند بر روی محیط کشت مایع مغذی و هیسترین اسکرام مایع برده شد.سپس روی شیکر انکوباتور در دور rpm 150 و دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 5-3 روز کشت داده شدند. پس از مشاهده کدورت و به دست آوردن توده سلولی، توده سلولی به وسیله سانتریفیوژ در دور rpm 6000به مدت 10 دقیقه از محیط کشت جدا شد و نهایتا سوپر ناتانت(محلول رویی) جهت تولید نانوذرات نقره برداشته گردید و جهت بررسی تولید، 50 سی سی از سوپرناتانت279 مورد آزمایشدر ارلن های 100 سی سی وارد گردید. به صورت جداگانه محلول نیترات نقره 1 مولار(1689/0 گرم از نیترات نقره در 1 سی سی آب مقطر استریل) تهیه شد. سپس 50 مایکرولیتر از محلول 1مولار نیترات نقره به ارلن مورد آزمون وارد و نهایتا نمونه ها در شیکر با دور rpm 200 در دمای 45-40 درجه سانتی گراد به مدت 1 روز قرار گرفتند. تجمع نانوذرات نقره با تغییر رنگ محیط کشت بررسی گردید. شاهدهای مورد استفاده شامل محیط کشت استریل به همراه نیترات نقره 1 میلی مولار بود(Rozamond et al ., 2004; Alexander et al., 2003).
3-2-7-تست های تاییدی تولید نانوذرات نقره
3-2-7-1- اسپکتروفوتومتری280
همانگونه که اشاره گردید تایید اولیه تولید نانوذرات فلز نقره بر اساس تغییر رنگ محیط آزمون به دلیل تغییر ماهیت مواد به صورت نانوذره می باشد. پس از مشاهده تغییر رنگ حاصله، نمونه ها توسط اسپکتروفوتومتر در دامنه طول موج از 350 تا 750 نانومتر بررسی شدند.
روش اسپکتروفوتومتری برای تمامی نمونه های حاوی تغییر رنگ انجام شد. بلانک مورد استفاده در اسپکتروفوتومتر، سوپرناتانت میکروارگانیسم کشت داده شده در محیط کشت نوترینت براث بود که نمک فلز به آن افزوده نشده بود. تولید نانوذرات نقره در اسپکتروفوتومتر، جذبی حدود 410 تا 450 نانومتر را نشان داد (Binupriya et al ., 2010b).
3-2-7-2- پراش اشعه ایکس281
در ابتدا نمونه های سوپرناتانت حاوی نانوذره نقره در دستگاه خشک کن282 قرار گرفت و خشک گردیدند. سپس پودر حاصله برای هر نمونه به صورت جداگانه تحت مطالعه توسط دستگاه پراش اشعه ایکس((XRD در زاویه2? از 30 درجه تا 80 درجه قرار گرفت(Rathnayakeet al ., 2012).
3-2-7-3- بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره283
سوپرناتانت حاوی نانوذره نقره به مدت 30 ثانیه تا 1 دقیقه در مجاورت گرید های مسی حاوی پوشش کربنی قرار داده شدند و پس از خشک شدن نمونه ها توسط لامپ مادون قرمز284، نمونه ها توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره مشاهده و از آن ها عکسبرداری شد(Kathiresan et al ., 2009).
3-2-8- انتخاب سویه های مناسب جهت ادامه آزمون ها
از میان باکتریهایی با توانایی تولید نانوذرات نقره و سلولز آنهایی انتخاب شدند که دارای هر دو توانایی مذکور بودند و دلیل دیگر تکیه بر میزان تولید نانوذرات نقره و سلولز بود که مشاهده شد این سویه ها در حد مناسبی توانایی تولید نانوذرات نقره و سلولز را به همراه هم دارا بودند.
3-2-8-1-تولید نانوذرات نقره درون بستر سلولزی به روش آر-تی
ابتدا طبق روش گفته شده در بخش 3-2-1 بستر سلولزی تولید و سپس طبق روش گفته شده در بخش3-2-3 سلولز تولیدی خالص سازی شد سپس لایه سلولزی درون بشر استریل وارد شد و در محلول سوپرناتانت باکتری تولید کننده آن قرار گرفت. شرایط تولید نانوذره نقره طبق بخش3-2-6 فراهم شد و سپس نمونهها جهت بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی نگاره قرار گرفتند.
3-2-9-بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره
برای این منظور ابتدا کشت 24 ساعته از باکتری های بیماریزا اشرشیا کلای، استافیلوکوکوس آرئوس، سودوموناس آئروژینوزا و باسیلوس سرئوس بر روی محیط آگار مغذی تهیه و سپس از هر تک کلونی از باکتریها درون محیط کشت مایع مغذی وارد شد و پس از 24-18 ساعت کدورت محیط کشت بررسی شد تا به استاندارد 5/0 مک فارلند رسید. سپس مقدار 100 مایکرولیتر از کشت باکتری های بیماریزا برروی محیط کشت مولر هینتون آگار285 اضافه و کشت سفره ای داده شد. نهایتا از لایه سلولزی خالص قبل از تولید نانوذرات به عنوان شاهد و لایه سلولزی پس از تولید نانوذرات نقره جهت بررسی رشد، روی پلیتها به صورت دیسک هایی قرار داده شد سپس پلیت ها به مدت 24-18 ساعت در گرمخانه 37 درجه سلسیوس قرار گرفت. پس از آن پلیت ها، جهت مشاهده از نظر تشکیل یا عدم تشکیل هاله مهار رشد باکتری از گرم خانه خارج و بررسی شدند. در این مرحله برشهایی همسان به قطر 6 میلی متر از لایه سلولزی خالص قبل از وجود نانوذرات به عنوان کنترل استفاده شدند(Yang et al., 2012).
3-2-9-1-تهیه محلول استاندارد نیم مک فارلند
محلول کلرید باریم دو آبه (BaCl2,H2o) با غلظت 175/1 % تهیه شد. (محلول شماره 1 ) سپس محلول اسید سولفوریک 1 % تهیه شد. (محلول شماره 2 ) و نهایتا5 /0 میلی لیتر از محلول شماره 1 به آرامی با 5/99 میلی لیتر از محلول شماره 2 مخلوط شد. جذب نوری286 محلول حاصل توسط دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 625 نانومتر اندازه گیری شد ، کدورت این محلول معادلcfu/ml 108 × 5/1 از سوسپانسیون باکتری است.
3-2-10-نگهداری طولانی مدت سویه ها(روش گلیسرول استوک)287
جهت نگهداری سویه ها، از تک کلنی های به دست آمده طی مرحله قبل بر روی محیط کشت نوترینت براث در درون ارلن استریل کشت تازه داده شد و نمونه ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس بر روی شیکر انکوباتور در دور rpm 150 قرار گرفتند. سپس هر نمونه سانتریفیوژ و رسوب ته ارلن به همراه میزان کمی از محلول بالای ارلن به صورت غلیظ شده آماده شد.سپس 500 مایکرولیتر از این محلول غلیظ به 500 مایکرولیتر گلیسرول 30% در میکروتیوب جدید اضافه سازی شد و به خوبی ورتکس گردید. نهایتا نمونه ها در فریزر 20 – درجه سلسیوس درجه سلسیوس جهت نگهداری قرار داده شدند(Gericke and Pinches, 2006).
فصل چهارم
نتایج و بحث
4-1-جداسازی سویه های باکتریایی از سرکه و بررسی تولید سلولز توسط آنها
در کل حدود 65 جدایه سرکه گردآوری و بررسی شدند که 45 جدایه باکتریایی توانایی رشد بر روی محیط کشت هیسترین اسکرام را داشتند. 34 جدایه از این باکتریها پس از بررسیهای اولیه فنوتایپی گرم منفی و جزء جنس استوباکتر و گلوکونوباکتر طبقه بندی شدند. در حالیکه بقیه جدایه ها گرم مثبت بودند. از میان 34 جدایه تایید شده 20 جدایه توانایی تولید لایه سلولزی را داشتند. همانطور که در مبحث مواد و روشها آورده شده است از خصوصیات این لایه این است که لایه ای سفید، قطور، محکم و سفت می باشد که تایید کننده لایه سلولزی است. از بین این 20 جدایه جهت مطالعات بیشتر، 5 جدایه که بالاترین توانایی تولید لایه سلولزی را دارا بودند انتخاب شدند. همانگونه که در فصل دوم آورده شد، 1سویه میکروبی به نام استوباکتر زایلینوس نیز به عنوان شاهد

دیدگاهتان را بنویسید